Пцр амплификатор своими руками

Оружие генетика: какие инструменты помогают трансформировать жизнь

Наталия Киеня

Все мы не раз видели эту картину: тонкая игла под микроскопом входит в полупрозрачную живую клетку, чтобы перенести туда ДНК. Но какие приборы нужны для того, чтобы сделать это? «Теории и практики» составили список самых интересных устройств, с помощью которых генетики проводят искусственное оплодотворение, создают генномодифицированные растения и определяют родство.

Электронный микроскоп: возможность видеть молекулы

Электронный микроскоп отличается от привычного нам оптического почти так же сильно, как компьютер отличается от печатной машинки. В этом приборе не используется свет: иначе говоря, мы никогда не сможем увидеть ДНК под ним в полном смысле этого слова. Размеры и форму объектов можно определить благодаря потоку электронов, которыми «обстреливают» молекулярные структуры. Частицы ударяются о свою мишень, отскакивают в разные стороны, и по траектории их полета ученые могут составить изображение того, что находится под электронным микроскопом.

Мы пока неспособны сфотографировать отдельную молекулу ДНК — знаменитую двойную спираль с двумя палочками сахаро-фосфатных стержней и миниатюрными перемычками — нуклеотидами. Для наблюдения за таким хрупким объектом наши электронные микроскопы слишком грубы, и потоки частиц неизменно успевают разбить структуру раньше, чем будет составлено ее изображение. Однако в начале 2012 года группе ученых из Генуи удалось запечатлеть «веревочку» ДНК, составленную из шести молекул, обернутых вокруг еще одной, седьмой. Для этого им пришлось создать абсолютно новую подложку с микроскопическими опорами, на которых ДНК была натянута, как телеграфный провод на столбах.

Микропипетка: перенос ДНК

Современные микропипетки — это высокоточные инструменты, способные дозировать крошечные объемы жидкости: от 1 до 1000 микролитров. Их можно найти в любой лаборатории или исследовательском центре, где проводится ПЦР-диагностика или другие генетические исследования.

Внешне микропипетки одновременно напоминают шприцы и шариковые ручки. В отличие от обыкновенной пипетки с мягким резиновым колпачком, микропипетка обладает крошечным тонким поршнем. Специалист просто нажимает на него большим пальцем, как на кнопку, поршень входит в узкий стеклянный капилляр, вытесняя из него воздух или жидкость. У микропипеток часто есть цветовая маркировка, чтобы можно было различить устройства разного объема. Также встречаются микропипетки с несколькими капиллярами — так называемыми «многоканальными модулями». Такие устройства позволяют забирать одинаковый объем жидкости сразу из нескольких пробирок или контейнеров.

Микроманипулятор: искусственное оплодотворение

Микроманипулятор — это прибор, позволяющий осуществлять тонкие и точные движения микроинструментов. С его помощью можно удалить или перенести клеточное ядро, сделать инъекцию в цитоплазму и др. Без приборов, руками эти действия выполнить невозможно: слишком мало давление, которое можно приложить к крошечному клочку материи. Вот почему все нужно делать с помощью джойстика и механизма, снижающего силу движения человеческих пальцев.

Микроманипулятор состоит из системы штативов с винтами, которые зажимают микроинструменты и обеспечивают их движение во всех направлениях. Также для работы необходима влажная масляная камера. Слой масла нужен, чтобы удержать клетку на месте и предохранить ее от высыхания.

Именно с помощью микроманипулятора специалисты проводят искусственное оплодотворение. Также прибор незаменим в генетических исследованиях: все инъекции растворов, в том числе, внесение в одиночную клетку новой ДНК in vitro, осуществляются с использованием микроманипулятора.

Биолистическая пушка: трансформация растений

Биолистическая пушка — один из самых распространенных инструментов генной инженерии растений (особенно однодольных: пшеницы, ячменя, кукурузы и др.). Она стреляет частицами вольфрама, на которые перед работой напыляют ДНК. Специалисты наносят эти «генетические пули» на целлофановую подложку и помещают в пушку. Под «стволом», на расстоянии 10-15 см, устанавливают чашку с растительной тканью, или каллусом — клетками, которые позже можно будет культивировать. После этого происходит выстрел. Вакуумный насос резко уменьшает давление в «стволе», и пушка на огромной скорости выбрасывает вольфрамовые частички. Они разрывают стенки клеток, без труда входят в цитоплазму и ядра клеток и доставляют туда ДНК. Из-за силы бомбардировки ткань по центру чашки, как правило, погибает. Однако по периметру клетки остаются живы и хорошо протрансформированы. Их и культивируют в дальнейшем, чтобы получить трансгенный сорт растения.

Электропоратор: трансформация животных

Электропоратор — еще один прибор для трансформации клеток живых существ: от бактерий и дрожжей до млекопитающих, а также растений. Перед работой раствор с живыми клетками и дополнительными молекулами ДНК помещают в пластиковые кюветы с алюминиевыми электродами. Затем электропоратор с помощью электрического поля создает в мембранах клеток крошечные поры, сквозь которые генетические конструкции проникают в цитоплазму. После завершения процесса поры закрываются, и клетки остаются целы и невредимы.

Сегодня электропорация считается самым простым и эффективным методом введения молекул ДНК в клетки. До недавнего времени он, впрочем, использовался не так часто из-за отсутствия серийного производства электропораторов.

Амплификатор: ПЦР

Амплификатор можно найти практически в любом медицинском центре, где проводятся генетические исследования. Он и позволяет проводить полимеразную цепную реакцию (ПЦР), после которой специалисты уже с помощью другого прибора находят, идентифицируют и подсчитывают различные фрагменты ДНК. Амплификаторы применяются при проведении клинических анализов и судмедэкспертизы, в ходе научных исследований, а также для экологического и санитарного контроля.

Метод ПЦР (полимеразной цепной реакции) основан на поиске и многократном копировании определенных участков ДНК, которые соответствуют заданным критериям. Для этого используется особый фермент — полимераза. Весь процесс протекает in vitro.

В ходе ПЦР специалисты нагревают и охлаждают пробирки с образцами, полимеразой и праймерами — короткими фрагментами нуклеиновой кислоты, комплементарными ДНК- или РНК-мишени. Мишенями всегда являются одиночные нити ДНК, к которым в определенном месте должен присоединиться праймер.

Процесс начинается с того, что температуру в пробирках повышают до 94-98°С. В этот момент водородные связи в двойных спиралях распадаются, и все одиночные цепочки оказываются сами по себе. Затем пробирки начинают охлаждать, чтобы праймеры с помощью новых водородных связей могли связаться со своими мишенями и образовать молекулы. Ну, а после этого, на финальной стадии, в дело вступает фермент, который на основе получившихся структур синтезирует множество дочерних ДНК — точных копий родительской молекулы. Они и нужны специалистам, чтобы провести анализ.

Анализатор нуклеиновых кислот: диагностика и судмедэкспертиза

Анализатор нуклеиновых кислот, или АНК, — второй необходимый для ПЦР-диагностики прибор. Когда реакция завершается, в это устройство переносят «переживший» полимеразную цепную реакцию образец. Ученые с помощью АНК подсчитывают, сколько искомых молекул возникло в пробирке, а также оценивают их качества.

Сегодня существуют анализаторы нуклеиновых кислот, которые работают в режиме реального времени. При наличии такого прибора амплификатор специалистам не нужен: весь процесс, от стадии нагревания пробирок до подсчета молекул прибор выполняет сам.

Секвенатор: исследования генома

Секвенирование — это процесс определения последовательности нуклеотидов в молекулах ДНК. Именно оно позволяет нам читать геномы и исследовать их. Правда, сегодня не существует ни одного метода, который работал бы для всей молекулы целиком. Чтобы определить, как расположены нуклеотиды в ниточке ДНК, специалистам всегда приходится сначала разделить ее на множество небольших участков. Затем ученые проводят ПЦР: нагревают и охлаждают эти «генетические кусочки» в пробирках с праймерами и ферментом. В результате появляется множество копий искомого участка ДНК. Секвенатор может прочитать каждую из них.

Источник

Сам себе экспериментатор

Как сделать биологическую лабораторию у себя дома

В нулевом приближении работа в биологической лаборатории похожа на приготовление еды. Только кастрюли, половники и ложки заменяются на пробирки с дозаторами, вместо продуктов нужно покупать химические реактивы и биологические препараты, а в конце результаты оцениваются не вкусовыми рецепторами, а на специальных приборах. В остальном все примерно так же. Хорошие инструкции, аккуратные руки, внимательность — и даже в домашних условиях вы сможете выделить ДНК, вырастить бактериальные культуры и отредактировать геном. N + 1 совместно с командой разработчиков «Авито» разобрался, как собрать простейшую биологическую лабораторию за пределами научного института или фармкомпании.

Инструменты и расходники: скрытые герои

Первое, с чем нужно определиться — это помещение. Вам понадобится 15-20 квадратных метров свободного пространства, 2-3 стола и компьютер для управления приборами и обработки полученных результатов. Также всячески рекомендуется, чтобы помещение было хорошо проветриваемым, имело окна, подключенный источник проточной воды и возможность установки вытяжки. Если с этими пунктами все получается, то можно двигаться дальше.

Почти в каждой научной статье есть раздел, в котором подробно описывается, какие приборы и методики использовали в своей работе ученые, но в этих текстах никто никогда не упоминает, например, о марках использованных нитриловых перчаток. Стеклянная посуда, халаты, микродозаторы — все это темная материя биологических исследований, исподволь влияющая на любые их результаты, и поэтому собирать нашу лабораторию мы начнем именно с этих мелочей.

Первое, что обязательно понадобится, — это халаты и одноразовые перчатки, которые не только защищают исследователя от опасных химических реагентов и патогенов, но и препятствуют загрязнению образцов вашими тканями. Также хорошо установить в домашнюю лабораторию ламинарный бокс, обеспечивающий условия для стерильной работы, и добавить к нему автоклав, ультрафиолетовую лампу и горелку, необходимые для обеззараживания инструментов и различных поверхностей.

Следующий обязательный пункт — это микродозаторы, с помощью которых можно с высокой точностью набирать фиксированные объемы жидкостей для приготовления растворов. Именно с них начинается путь многих молодых экспериментаторов, и иногда даже кажется, будто вся жизнь в лаборатории сводится к этим простым и почти медитативным действиям: насадил насадку на дозатор, набрал жидкость, вылил жидкость, снял насадку.

Другие мелкие расходники одной строкой: ступки и пестики для измельчения реактивов, штативы, разнообразные шпатели, скальпели, пинцеты и другие колюще-режущие инструменты, герметизирующая пленка парафильм (подкладку, на которую наклеен парафильм, тоже пускают в дело и традиционно используют для взвешивания). Полный список лабораторных мелочей может стремиться к бесконечности, и поэтому лучше всего раздобыть себе минимальный набор вроде оговоренного выше, чтобы, приступив к экспериментам, докупать недостающее оборудование в процессе работы.

Приборы: скелет лаборатории

Когда в 70-80-х годах прошлого века в лаборатории стали приходить антропологи, которые исследовали повседневную работу ученых, как до этого изучали туземные народы или маргинальные городские группы, то сперва они сильно удивлялись: никаких фонтанирующих открытий, озарений и Архимедов, выпрыгивающих из ванн, а вместо этого ежедневная рутина с постоянным повторением одних и тех же действий.

Во многом эти ощущения были верны. Так или иначе все научные эксперименты требуют систематичности и поэтому, наверное, около 90 процентов времени начинающего экспериментатора занимает ремесленная работа по обслуживанию научных приборов (с продвижением вверх в научной иерархии это соотношение неизбежно меняется).

Если пытаться как-то классифицировать наши покупки, то все приборы можно будет разбить на две большие группы. Одни из них помогают подготовить образцы для анализов, а другие — провести эти самые анализы.

Начнем с первой группы. Прежде всего нам понадобятся аналитические весы с точностью хотя бы на уровне миллиграммов (иначе будет очень сложно приготовить нужные объемы некоторых растворов). Кроме них в повседневной рутине наверняка пригодятся водный дистиллятор или тридистиллятор для очистки воды от солей и биологических примесей (правда, для точности первых экспериментов полностью хватит и обычных систем очистки питьевой воды), термостатирующий шкаф — инкубатор для выращивания культур, шейкер, холодильник с морозильной камерой, магнитная мешалка и центрифуга для разделения смесей (вместе с эппендорфами или другими пластиковыми емкостями). Все это устройства широкого научного профиля, необходимые не только в биологических, но и физических, химических, материаловедческих и прочих лабораториях.

Вторая группа, о которой говорилось выше, — это приборы для проведения различных анализов. Если бы инопланетяне попытались описать деятельность земных лабораторий с опорой на какие-нибудь численные метрики, то они наверняка назвали бы их фабриками по производству данных: таблиц, графиков, изображений и бесконечных массивов чисел. Поэтому приборы для проведения анализов — это ключевая часть лабораторий. Они позволяют проникнуть в природу процессов, происходящих за завесой рутины, и помогают представить результаты экспериментов остальному миру: коллегам, спонсорам, коммерческим партнерам и обычным людям.

Но достать эти научные приборы значительно сложней. Во-первых, они заметно дороже большинства перечисленных выше вещей (кроме, возможно, ПЦР-реактора и термошкафа), а во-вторых, в России их часто не продают физическим лицам. Поэтому стоит поискать возможность приобрести подержанные приборы (например, оптический микроскоп) или попытаться собрать их самостоятельно из более доступных комплектующих.

В интернете можно найти немало инструкций, как сделать своими руками самые разные приборы, например устройство для проведения гель-электрофореза, с помощью которого можно разделить ДНК или фрагменты ДНК по массам, что часто необходимо в генетических экспериментах. Некоторые умельцы рассказывают даже, как в домашних условиях смастерить секвенаторы — крайне дорогостоящие приборы, необходимые для определения последовательности ДНК.

Реактивы и препараты: ингредиенты рецептов

Еще ни слова не было сказано про реактивы и биологические препараты, с которых, естественно, начинаются все эксперименты. Этот разговор мы отложили не случайно. Если вы откроете сайт любой российской фирмы, торгующей этими «продуктами», то вас немедленно засосет водоворот бесконечных наименований, многие из которых сложно понять без фундаментального биологического образования: кислоты, соли, буферы, сахара, красители, питательные среды, ферменты, плазмиды и далее по списку.

Поэтому в выборе ингредиентов лучше всего отталкиваться от экспериментов, которые вы хотите провести, тем более что сейчас можно найти много подробных инструкций для таких экспериментов. В самых простых из них вроде выделения ДНК или выращивания бактериальных культур можно обойтись без дополнительных покупок.

Например, для выделения молекул ДНК может вполне подойдет свежая свиная печень: нужно отделить от нее маленький кусочек, нарезать его на мелкие фрагменты скальпелем и смешать в пробирке с раствором поваренной соли. После этого полученную смесь нужно процедить через фильтровальную бумагу в другую пробирку и добавить туда раствора додецилсульфата натрия. Это вещество разрушает клеточные мембраны и в результате молекулы ДНК будут постепенно выходить в свободной форме в раствор — останется только отделить от остального содержимого клетки. Для этого используют спирт изопропанол, предварительно охлажденный в холодильнике. Его осторожно добавляют в пробирку с разрушенными клетками, так чтобы изопропонал не смешивался с водой, и в результате на границе раздела воды и спирта начинает появляться мутноватый осадок, состоящий из молекул ДНК. Дальше останется только аккуратно извлечь его из пробирки, например, намотав на стеклянную палочку.

При этом специфические вещества в этом опыте можно заменить на более общедоступные: вместо додедцилсульфата использовать концентрированный раствор моющего вещества, а изопропанола — медицинский спирт. Но для более сложных экспериментов, например, создания генетически модифицированных бактерий, уже понадобятся разные специфические вещества, которые в России могут приобрести и физические лица.

Движение DIY-биологии еще очень молодо и пока не может соперничать с устоявшимися системами академической и индустриальной науки, но рано или поздно все может измениться. Во всяком случае, некоторые приборы, сделанные в гаражах, уже соперничают с индустриальными аналогами, да и наука, в конце концов, это не только история про достижения, но и про страстное желание просто что-то попробовать, поэкспериментировать. В том числе и дома, почему нет?

Только не забывайте: большие достижения будут случаться редко, а мелкие ошибки, наоборот, постоянно. Социолог и антрополог науки Бруно Латур даже называет лаборатории «технологическим аппаратом для обретения силы посредством умножения количества ошибок». Так что будьте готовы к неудачам и рутине, заведите лабораторный дневник — и вы обязательно приготовите что-то интересное.

Источник